本发明公开一种以玉米胚芽蛋白为原料工业化生产降压活性肽的方法，属于食品营养和生物技术领域。本发明采用Alcalase 2.4L以及木瓜蛋白酶和Dispase II对玉米胚芽蛋白连续酶解，然后通过离心、超滤、浓缩和喷雾干燥等工序，制得玉米降压活性肽。所获降压活性肽中分子量小于1000Da的组分占92％以上，特征降压肽段丙氨酸-酪氨酸(Ala-Tyr，AY)在0.6％以上。经检测表明，玉米降压活性肽具有良好的体外ACE抑制活性以及对温度、pH值和主要胃肠消化酶的稳定性，并且对原发性高血压大鼠具有明显的体内降血压作用。本发明的生产方法具有生物活性高、加工成本低、处理量大、便于工业化生产的优点，以此方法制备的玉米降压活性肽可以作为新的功能性营养成分应用于食品、保健食品和药品的开发与生产，具有广阔的市场前景。
1.一种利用玉米胚芽蛋白制备活性肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1)将玉米胚芽蛋白粉加入反应罐中，以100：6～12L：kg的液料比用水与玉米胚芽蛋白粉混配调浆，调整pH值范围为9～11，加热至50～80℃，保温搅拌20～60min；2)将反应罐中的料液离心分离，收集渣料，将渣料加水稀释，加热至50～80℃，搅拌并分离，重复3次，收集纯化后的渣料；3)纯化后的渣料以100：40～50的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7～9，加热至40～60℃，按每克蛋白质2000～5000单位酶量加入Alcalasexa02.4L，反应3～5小时，然后，按每克蛋白质1000～2000单位酶量加入比例为1：1的木瓜蛋白酶和Dispasexa0II，温度45～55℃，酶解1～2小时，最后，将酶解液加热灭酶；酶解后的料液通过分离、浓缩、脱色和干燥工艺制得玉米降压活性肽粉，具体步骤如下：1)对所得到的酶解液进行离心，转速12000～16000r/min，留用离心清液，用孔径0.05～0.1μm的膜过滤设备进行过滤，条件为压力0.2～0.4MPa，温度30～80℃，制得澄清的活性肽透过液，2)将上述活性肽透过液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固含量为20～50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40～80℃，按照浓缩液总固含量5％的比例加入活性碳粉进行脱色，并过滤，3)用离心喷雾干燥器将上述脱色后的浓缩液进行干燥处理，条件为进口温度160～180℃，出口温度80～90℃，制成活性肽粉，所述活性肽粉中分子量小于1000Da的组分总共占92％以上，游离氨基酸含量低于5％，并至少含有0.6％的丙氨酸-酪氨酸序列肽段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液加热灭酶的条件是，加热到120℃，灭酶10min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将反应罐中的料液离心分离时采用片式离心机。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对酶解液进行离心是采用管式离心机。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜过滤设备选自微滤或超滤设备。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述活性肽透过液采用双效降膜蒸发器进行蒸发浓缩。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入活性碳粉进行脱色的条件为加热到80℃，保温并搅拌20-40min。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备的活性肽，其特征在于分子量小于1000Da的组分占92％以上，游离氨基酸含量低于5％，并至少含有0.6％的丙氨酸-酪氨酸序列肽段。
9.根据权利要求1-7任一项所述方法制备的活性肽作为产品或原料在保健功能性食品或药剂中的应用。技术领域
本发明涉及以玉米胚芽蛋白为原料，制备玉米降压活性肽的工业化生产方法，产品可应用于功能食品和营养保健制品，属生物技术领域。
背景技术
蛋白质是人体所需的一种主要的营养成分，传统的蛋白代谢模型认为，作为食品营养摄取的蛋白质和多肽必须先由胃和小肠内的多种蛋白酶水解成为游离氨基酸，才能被人体吸收利用。现代研究表明，人体摄入的蛋白主要是以多肽形式从肠道直接吸收。氨基酸和肽的吸收转移机制不同，肽的吸收效率更高且不易饱和，例如二肽和三肽的吸收速度高于同一组成的氨基酸。将天然蛋白质经酶水解，大分子的蛋白质酶切成小分子的肽段，不但利于消化吸收，而且可以获得多种生物活性肽。生物活性肽是指对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，相对于蛋白质而言，活性肽的分子小，但生物活性高，少量肽即可发挥极其重要的生理作用。自1975年Hughes等首先报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽以来，人们已经从动、植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽。经酶解天然来源蛋白后得到的生物活性肽类制品具有易吸收、抗氧化、抗疲劳、降血脂、降血压、增强免疫力等一系列生理功能，而且具有原料来源广泛、无毒副作用、可规模化生产、价格便宜等优点，生物活性肽的研究开发在近年来已经成为全球食品和营养等相关领域研究的一个重大发展方向。目前欧美、日本以蛋白质含量较高、组成较全面的天然食物资源为来源，利用适当酶解等分离工艺条件，已经实现一些生物活性肽的产业化生产，形成年产值上十亿美元的新兴保健和食品加工产业。高血压是对人类健康威胁极为严重的一种疾病，2007年发布的全球《高血压影响报告》发出警示，患高血压疾病人数在全球呈增长趋势，目前已达10亿人；如不采取有效措施，2025年前，全球将有15.6亿人患上这一疾病，包括中国在内的一些国家中，高血压患者可能增加80％。血管紧张素I转化酶(angiotensinxa0I-convertingxa0enzyme，ACE)是一种多功能的二肽羧肽酶，ACE可将没有生理活性的血管紧张素I转化为具有升压效应的血管紧张素II，还可将血管舒缓激肽(Bradykinin)降解为失活片段，导致血管收缩，从而造成血压升高。利用ACE抑制剂抑制ACE活性，从而阻碍血管紧张素I转化为血管紧张素II，已成为高血压防治中的主要手段。在上世纪60年代，Ferreira首次从巴西茅头蝮蛇(Bothropsxa0Jararaca)毒液的乙醇浸提液中发现具有增强血管舒缓激肽生理效果的多肽，并称之为舒缓激肽增强因子(Bradykininxa0potentiatingxa0factor，BPF)。随后，Bakhle和Ondetti等的研究证实BPF就是具有ACE抑制活性的多肽。基于对BPF的分子结构分析，Cheung和Cushman合成了第一种人工降压药物Teprotide(SQ20881)，这种壬肽具有很强的ACE抑制活性和体内降压效果，但只能静脉注射，无法口服，从而限制了应用。自从Captopril问世以后，ACE抑制剂的新品种不断出现，迄今已有30多种人工合成ACE抑制剂进入临床研究或应用。虽然这些人工抑制剂具有显著的降血压效果，但同时也会引起诸多的副作用，例如咳嗽、过敏、皮疹、水肿、心律失常和肾脏损害等。因此，目前关于研究和开发更为安全、有效的ACE抑制剂的呼声日益高涨。随着“回归自然”理念和生物活性肽研究的兴起，从天然动、植物资源中提取安全有效、无毒副作用的ACE抑制肽，已成为高血压防治研究中的一个热点。Oshima等最早从食品蛋白质源中获得ACE抑制肽，用细菌胶原酶降解明胶获得6条活性较强的序列，通过Sephdexxa0G-25证实抑制ACE活性的大部分主要集中在分子量较小的部分。这是第一次用体外蛋白酶降解得到的由食品蛋白产生的活性肽，为后来研究生产食品蛋白质ACE抑制肽打下了基础。随后人们相继从无花果、金枪鱼、清酒、纳豆、酪蛋白、大蒜、大豆等天然来源中分离出新的ACE抑制肽。汤健等研究表明，大豆肽对SHR(原发性高血压)大鼠的血压调节有很大作用，服用三天后，即有显著的降压效应。Byun等人研究发现，鱼皮胶原水解物的相对分子质量分布在0.9-1.9kDa范围内，具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的作用。然而，这些研究大都限于实验室规模的探索试验，在工业上生产应用的实例尚不多见，迄今为止，在国内外投入工业化生产的食用食源性肽多为研究较早的大豆肽、乳肽、海洋肽等。玉米作为三大粮食作物之一，在世界粮食结构中占有重要的地位。目前，中国的玉米年产量约为1.1亿吨，占世界总产量的20％，其中近400多万吨用来生产淀粉，淀粉糖及酒精等。玉米胚芽蛋白粉是玉米湿法加工淀粉时的主要副产物，含有丰富的蛋白质，还含有无机盐及多种维生素等其它成分。目前中国国内主要将玉米胚芽蛋白粉用于饲料工业或自然排放，每年自然排放的玉米蛋白质高达10万吨，既浪费了宝贵的粮食资源，又造成对环境的严重污染。因此提高玉米的利用率，最大程度地回收玉米胚芽蛋白，有着重要的社会经济意义。目前从玉米胚芽蛋白粉中获取生物活性肽尚乏人研究。本发明采用蛋白酶解技术，建立从玉米胚芽蛋白粉中获取具有玉米降压活性肽的工业化方法，产品具有明确的特征组分和生物活性，对于充分利用我国丰富的玉米资源以及开拓功能食品和营养保健制品，具有巨大的实用价值和经济效益。
发明内容
本发明的目的是拓宽玉米胚芽蛋白的加工利用途径，建立从玉米胚芽蛋白中获取具有玉米降压活性肽的工业化方法。为实现上述目的，本发明采用碱热处理与连续酶解相结合的方法，将玉米胚芽蛋白粉以100∶6～12(L∶kg)的液料比与水混配调浆，调整pH值范围为9～11，加热至50～80℃，保温搅拌20～60min。然后将反应罐中的碱性料液泵入片式离心机中，分离成清液和渣料。收集渣料，将渣料加水稀释，加热至50～80℃，搅拌并分离。同样的处理方式重复3次。纯化后的渣料以100∶40～50的水渣比加水混合、搅拌，调pH至7～9，加热至40～60℃，按每克蛋白质2000～5000单位酶量加入Alcalasexa02.4L，反应3～5小时。然后，按每克蛋白质1000～2000单位酶量加入木瓜蛋白酶和Dispasexa0II(1∶1)，温度45～55℃，酶解1～2小时。最后，将酶解液加热到120℃，灭酶10min。玉米胚芽蛋白酶解液用管式离心机离心，转速12000～16000r/min，留用离心清液，用孔径0.05～0.1μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.2～0.4MPa，温度30～80℃。玉米降压活性肽透过液用双效降膜蒸发器蒸发，直到浓缩液的固含量为20～50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40～80℃。按照浓缩液含量5％的比例加入活性碳粉进行脱色，加热到80℃，保温搅拌20～40min，然后采用卷式纳滤膜过滤。玉米降压活性肽浓缩液用离心喷雾干燥器进行干燥处理，条件为进口温度160～180℃，出口温度80～90℃，最后制成玉米降压活性肽粉。制备的玉米降压活性肽经过化学成分分析确定基本的理化成分，并通过高效液相色谱检测玉米降压活性肽成分的分子量分布，发现分子量小于1000Da的组分总共占92％以上，游离氨基酸含量低于5％。经体外稳定性试验表明，对于30～100℃的温度范围、3～11的pH值范围变化，以及胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶的消化，玉米降压活性肽均具有良好的稳定性。体外试验表明，玉米降压活性肽具有良好的体外ACE抑制活性。经采用液相色谱分离与质谱分析，对玉米降压活性肽中的肽段进行分离及结构鉴定，鉴定出7个具有生理活性的肽段，其中特征性降压肽段丙氨酸-酪氨酸(Ala-Tyr，AY)占0.6％以上。玉米降压活性肽的体内降血压效果以原发性高血压大鼠(SHR)为模型进行验证，证实具有良好的体内降血压效果，可应用于保健性功能食品及药品领域。
附图说明
下面对附图进行简要说明。图1是不同条件下玉米降压活性肽的反相色谱图。A为不同温度条件下的反相色谱图(由上至下分别对应20℃、40℃、60℃、80℃、100℃)；B为不同pH条件下的反相色谱图(由上至下分别对应pH为3、5、7、9、11)；C为不同体外消化条件下的反相色谱图(由上至下分别对应空白对照、胃蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化)。图2是玉米降压活性肽中标志性成分AY的液相质谱图。图3是玉米降压活性肽对原发性高血压大鼠血清中醛固酮浓度的影响。n＝8，**表示与空白对照组比较差异有显著性，P＜0.01。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。其具体工艺路线由以下步骤构成：1.玉米降压活性肽的制备将600kg玉米胚芽蛋白粉加入反应罐I中，以100∶9(L∶kg)的液料比用水与玉米胚芽蛋白粉混配调浆，调整pH值范围为10，加热至65℃，并保温搅拌40min。将反应罐中的碱性料液泵入片式离心机中，分离成清液和渣料。收集渣料，加入到反应罐II中，弃去清液。将渣料加水稀释，加热至65℃，搅拌并分离。同样的处理方式进行3次，以便除去油、淀粉、纤维和其他非蛋白物质。纯化后的渣料以100∶45的水渣比加水混合、搅拌。然后将玉米胚芽蛋白液调pH至8，加热至50℃，按每克蛋白质3500单位酶量加入Alcalasexa02.4L，此条件下反应4小时。然后，按每克蛋白质1500单位酶量加入木瓜蛋白酶和Dispasexa0II(1∶1)，温度50℃，酶解1.5小时。然后，将酶解液加热到120℃，灭酶10min。用管式离心机将酶解液离心，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液。将上述清液用孔径0.06μm的微滤和超滤设备进行过滤，条件为压力0.3MPa，温度55℃，制得澄清的玉米降压活性肽透过液。用双效降膜蒸发器将上述透过液蒸发，直到浓缩液的固含量为40％，条件为蒸汽压0.1MPa，温度60℃。按照降压活性肽浓缩液总固含量5％的比例加入活性碳粉，加热到80℃，保温搅拌半小时后，过滤。然后，用离心喷雾干燥器将玉米降压活性肽浓缩液进行干燥处理。干燥条件设为进口温度170℃，出口温度85℃。最后，制得116.25Kg玉米降压活性肽。2玉米降压活性肽的理化组成和分子量分布分析玉米降压活性肽的成分经理化分析结果为：总蛋白质89.28％，脂肪0.05％，灰分5.06％，水分5.21％。从中可以看出本发明制备的玉米降压活性肽总蛋白质含量超过85％，具有很高的产品质量。将玉米降压活性肽样品于GEL-HPLC中进样以后，用液相数据处理软件将玉米降压活性肽的凝胶色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，得到样品的肽的相对分子质量及其分布范围。分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值和生理功能。本发明以最小二肽(Gly-Gly)的分子量132Da和最大三肽(Trp-Trp-Trp)的分子量576Da作为分子量范围界值，用峰面积归一化法计算了玉米降压活性肽的相对分子质量分布范围，如表1所示。由分子量分布结果可以看出，分子量小于1000Da的组分总共占93.05％，如果按氨基酸的平均分子量137Da来计算，分子量1000Da以下的组分则多是八肽以下的低聚肽，也包括部分游离氨基酸。其中分子量在132Da-576Da的占78.17％，占据了1000Da以下的绝大部分，这部分主要是二肽、三肽和四肽。表1玉米降压活性肽的分子量分布ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>3.玉米降压活性肽的体外稳定性玉米降压活性肽样品分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下水浴2h后，其分子质量分布如表2所示。经不同温度水浴2h之后，玉米降压活性肽的组分中分子量在1000Da以下的总含量基本没有变化，均在93％左右。各个分子量区间的比例变化不超过2％。不同温度下玉米降压活性肽的反相色谱图如图1.A所示，从中可以发现，经不同温度水浴2小时之后，玉米降压活性肽的反相色谱图几乎没有变化，峰数目与出峰时间基本吻合。同时，经过相似度软件计算，其相似度均在0.99左右。表2不同温度条件下玉米降压活性肽的分子量分布比较ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>玉米降压活性肽样品在pH分别为3、5、7、9、11的条件下于37度水浴2h后，其玉米降压活性肽的分子质量分布如表3所示。不同pH条件下，37℃水浴2h之后，玉米降压活性肽的组分中分子量在1000Da以下的总含量基本没有变化，均在93％左右。各个分子量区间的比例变化不超过1％。不同pH下玉米降压活性肽的反相色谱图如图1.B所示，从中可以发现，经不同pH条件下，37度水浴2小时之后，玉米降压活性肽的反相色谱图几乎没有变化，峰数目与出峰时间基本吻合。同时，经过相似度软件计算，其相似度均在0.99以上，即从分子极性方面来看，玉米降压活性肽的组成成分几乎没有变化。表3不同pH条件下玉米降压活性肽的分子量分布比较ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>玉米降压活性肽经胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，其分子质量分布如表4所示(C：空白对照；P：胃蛋白酶消化；T：胰蛋白酶消化；P+T：先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化)。不同消化方式下，玉米降压活性肽的组分中分子量在1000Da以下的总含量略有升高，但升高不到2％。各个分子量区间中，1000-576Da组分所占比例均略有降低，但降低不到1％，说明有很少量的肽段被酶解消化。相对应的，更低分子量区间的组分略有升高，且主要集中在132Da以下的区间，说明被消化的少部分组分主要分解成了小分子氨基酸。表4不同消化方式下玉米降压活性肽的分子量分布ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>经胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后的反相色谱图如图1.C所示，从中可以发现，经不同消化方式消化之后，玉米降压活性肽的反相色谱图略有变化，但主要的峰数目与出峰时间基本吻合。经过相似度软件计算，与对照组相比各个谱图的相似度均在0.93以上。即从分子极性方面来看，玉米降压活性肽的组成成分略有变化，但变化不大。4.玉米降压活性肽的体外ACE抑制活性和标志性肽段分析体外ACE抑制活性采用马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)法通过高效液相色谱检测，测定加入降压活性肽前后产物马尿酸的色谱峰面积差别即可反映它降压活性的变化。ACE抑制率按下式计算：ACE抑制率(％)＝(M-N)*100/N。其中M为空白对照组中马尿酸的峰面积(mAU·s)；N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积(mAU·s)。不同浓度的玉米降压活性肽溶液的ACE抑制率如表5所示，经过测定计算，玉米降压活性肽的IC₅₀为1.02mg/mL，说明具有良好的体外ACE抑制活性。表5不同浓度的玉米降压活性肽溶液的ACE抑制率ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>通过采用液相色谱分离与质谱分析，对玉米降压活性肽中的肽段进行分离及结构鉴定。目前，已鉴定出53个肽段的结构。通过与玉米蛋白质组学序列库对比，其中32个肽段的氨基酸序列与玉米蛋白质组学已有片段序列相符，说明这些肽段是由玉米蛋白质水解断裂而产生的。再通过生物活性肽数据库比对，发现其中包含具有降血压活性的丙氨酸-酪氨酸(Ala-Tyr，AY)。YanjunYang等研究发现(J.Agric.Foodxa0Chem.，2007，55(19))，AY为一种降血压肽段，其体外降血压活性IC₅₀为14.2μM。50mg/kg剂量经口灌胃SHR两小时后血压下降9.5mmHg。我们已研究出定量测定AY的高效液相色谱分析法。将玉米降压活性肽样品经前处理后，以反相C18填料为固定相，依据样品组分分子极性大小的差别进行分离，在紫外吸收波长220nm条件下检测，采用外标法进行定量，并对色谱图及其数据进行处理(图2)，计算得到AY的含量为1.13％。鉴于不同批次的玉米降压活性肽样品中均含有0.6％以上的AY，故将AY作为玉米降压活性肽中特征性成分。5.玉米降压活性肽对原发性高血压大鼠的降血压作用以原发性高血压大鼠为实验动物，分别灌胃给予不同剂量(0.45、1.35、4.05g/kg.bw)的玉米降压活性肽，空白对照组灌胃给予相应剂量的蒸馏水，阳性对照组灌胃给予10mg/kg.bw卡托普利。连续灌胃8周后，各组大鼠体重、心脏/体重比、心率无明显变化(P＞0.05)。试验期间，空白对照组大鼠的血压一直在200mmHg左右，且随着灌胃时间的延长，略有上升，但差异没有显著性(P＞0.05)。低剂量组大鼠的血压随着灌胃时间的延长，逐渐降低，第6周血压与空白对照组相比差异有显著性(P＜0.05)，且在第7周和第8周保持了这种显著性差异(P＜0.05)，血压降低了15.6％。中剂量组大鼠随着灌胃时间的延长，其血压降低但下降稍慢，直到灌胃第8周，其血压与空白对照组相比差异有显著性(P＜0.05)，血压降低了10.3％。高剂量组大鼠的血压在灌胃8周时间内，有略微的下降，但与空白对照组比较差异无显著性(P＞0.05)(表6)。高剂量组和卡托普利组的血清醛固酮浓度显著低于空白对照组(P＜0.01，图4)。试验结果表明，本发明的玉米降压活性肽具有明显的降血压作用，可以用作开发降血压药物和功能食品的原配料，具有巨大的发展前景。表6玉米降压活性肽对原发性高血压大鼠的降血压作用ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>注：n＝8，单位：mmHg。*表示与空白对照组比较差异有显著性，P＜0.05，**表示与空白对照组比较差异有显著性，P＜0.01。